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構建載體
發布時間: 2023-05-05 點擊次數: 731次構建載體最關鍵的一步就是設計引物引入酶切位點,一旦引物設計好,那接下來就非常簡單了,今天重點就來教教大家如何利用 snapgene 輕松獲得構建載體所需的引物序列。
1. 打開軟件,選擇第一個(紅線標記),然后輸入基因的 CCDS 序列(基因的 CCDS 序列可在 NCBI 數據庫中獲得)。
2.點擊 ok 后界面,圖中顯示的是會切割基因編碼序列的酶
3. 接下來點擊最上面的 Enzymes Noncutters,會顯示所有不會切割基因編碼序列的酶,這些酶都是我們可以用的,選酶的標準:要選擇不能切割目的基因序列并且質粒上含有的酶,還有就是最好是實驗室有的酶。
4. 確定了可以用的酶后,接下來需要確定設計引物時用的這兩種酶,確定方法:這兩種酶最好不要鄰近,最好使用雙酶切有共同 buffer 的酶,兩個酶切位點最好不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補),否則效果相當于單酶切。
5. 確定了所要用的酶之后,接下來需要做的就是設計引物并引入酶切位點(注意:一定要看清楚載體上 promoter 的方向,將 CDS 正向插入到 promoter 后面)。
6. 點擊左下角的 sequence,然后拉取上游一部分基因本身的序列,拉取的時候會顯示拉取的堿基的個數以及 Tm 值,拉取到 Tm 值 55 度左右就可以(55 度以上最好)。
7. 然后點擊 primer——add primer,選擇 top strand。
8. 點擊 insertions,在 site 位置處選擇你準備引入的酶,比如我要引入 EcoR I,那我就選擇它,然后點擊 insert,這樣我們就引入了該酶的酶切位點。
9. 接下來需要添加保護堿基,所有的酶的保護堿基都加三個,哪個堿基沒有要求,使 GC 含量及 Tm 值適中即可。
10. 這樣上游引物就設計好了,接下來需要檢測一下引物是否會形成發卡結構,可以應用OligoCalc,如果發現會形成發卡結構,那就需要對引物序列做出一些調整,直到發卡結構消失。
11. 接下來拉取基因的下游的一部分序列,用同樣的方法設計好下游引物,有一點需要注意的是,設計下游引物的時候選擇 bottom strand。
這樣構建載體所需的引物就設計好了,怎么樣,是不是感覺其實也沒有那么難,接下來就可以構建屬于你自己的載體了。
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